Chicken intestinal microbiota

Amostras e objetivos

Este estudo tem como objetivo compreender o microbioma de segmentos do intestino de frangos que ainda não eclodiram do ovo tratados com probióticos. A análise busca revelar as diferenças e semelhanças nas comunidades microbianas associadas a cada condição.

Pré-processamento

Nomenclatura

As amostras referentes às bibliotecas de amplicons 16S sequenciadas foram nomeadas de acordo com o padrão:

CODE	TREATMENT
C	Control
V	Vehicle
P	Probiotic
A	Antibiotic

CODE	SEGMENT
D	Duodenum
J	Jejunum
I	Ileum
C	Cecum

CODE	SEX
M	Male
F	Female

<TREATMENT><SEGMENT><SEX><BIOLOGICAL REPLICATE>

Processamento dos dados

Análise de qualidade das amostras pré-processamento

A avaliação de qualidade foi realizada com FastQC v0.11.9 utilizando os parâmetros pré-definidos (default) para as leituras R1 e R2 de cada amostra, e, por fim, os relatórios individuais foram reunidos em um relatório final com MultiQC v1.13.dev0.

Programas:

FastQC: A high throughput sequence QC analysis tool. - fastqc v0.11.9 MultiQC: Aggregate results from bioinformatics analyses across many samples into a single report. - multiqc v1.13.dev0

Resultados da Avaliação de qualidade (prévia)

MultiQC Report - R1 MultiQC Report - R2

Verificação dos iniciadores (primers)

O módulo search_oligodb do programa usearch v11.0.667 foi utilizado para a busca pelas sequências dos pares de oligos iniciadores (primers) utilizados na amplificação dos fragmentos. Essa busca ocorreu considerando as primeiras 500 sequências, no máximo 2 mismatches e buscando em ambas as orientações.

Programa:

USEARCH: search and clustering algorithms that are often orders of magnitude faster than BLAST. - USEARCH v11.0.667, módulo -search_oligodb.

Os primers utilizados na verificação foram:

DNAStringSet object of length 2:
    width seq
[1]    17 CCTAYGGGDBGCWSCAG
[2]    21 GACTACNVGGGTATCTAATCC

Resultado da verificação dos iniciadores (primers)

Arquivos

Estimativas de tamanhos e qualidades das leituras (reads)

O módulo fastq_eestats2 do programa usearch v11.0.667 foi utilizado para a obtenção de um sumário mostrando a quantidade de leituras que passam em um filtros considerando limiares de estimativas de erros esperados (0,5, 1 e 2) em função de tamanhos de leituras (200pb a 300pb, com incremento de 10pb). Informações úteis para escolhas de parâmetros relacionados à poda de qualidade e fusão dos pares (R1 e R2) quando necessário.

O módulo fastq_eestats do programa usearch v11.0.667 também foi utilizado para a obtenção de relatórios de qualidade com estimativas de erro esperado. A documentação das colunas pode ser consultada no site do módulo.

Resultados das estimativas de tamanhos e qualidades das leituras

Arquivos *_trimSizes.txt

Arquivos *_eestats.txt

Estimativas das médias de erros esperados (reads)

Utilização do módulo fastx_info do programa usearch v11.0.667 foi utilizado para a obtenção da estimativa de erro médio dentro de cada biblioteca, considerando as suas reads.

Resultado das estimativas das médias de erros esperados (reads)

Arquivo meanEE.txt

Podas de bases de baixa qualidade

Em seguida, as leituras foram submetidas a podas de bases com baixa qualidade com o programa fastp v0.23.2, considerando a estratégia de janela deslizante, avaliando 5 bases a partir da extremidade direita, deslizando 1 base à esquerda e podando as bases da janela se a qualidade média dessas bases estiver abaixo de 10). O programa também foi configurado para descartar as leituras com a média de qualidade das bases abaixo de 10. As podas foram feitas independentemente para as leituras R1 e R2 de cada amostra.

Avaliação de qualidade das reads posterior à etapa de poda de qualidade

A avaliação de qualidade das reads foi realizada da mesma forma como descrito anteriormente.

Resultados da avaliação de qualidade das reads após a poda de qualidade

MultiQC Report - R1 MultiQC Report - R2

Fusão das reads R1 e R2 em sequências de amplicons

As leituras R1 e R2 do sequenciamento foram fundidas para a representação dos amplicons. Para isso foi utilizado o programa flash v1.2.11, considerando mínimo de sobreposição de 15 bases (–min-overlap 15) e um máximo de 250 bp (–max-overlap 250), além de um máximo de falhas na correspondência de 20% (–max-mismatch-density 0.2).

Obtenção dos amplicons utilizando os primers especificados

A obtenção dos amplicons via PCR in-silico foi realizada com o módulo search_pcr do programa usearch v11.0.667. Utilizando o primer forward e o primer reverse, que permitem a captura da região V3-V4 do gene 16S rRNA. Um máximo de 5 diferenças foi considerado como uma correspondência (match) aceita entre as sequências dos primers e as sequências dos amplicons.

Quando há mais do que um amplicon por leitura, então a maior é a selecionada com in-house Perl script GetLargestAmp.pl.

Avaliação de qualidade dos amplicons obtidos após PCR in-silico

A avaliação de qualidade dos amplicons foi realizada da mesma forma como descrito anteriormente para as reads.

Resultados da avaliação de qualidade dos amplicons

MultiQC Report - Amplicons

Estimativas de tamanhos e qualidades das leituras (amplicons)

Procedimento realizado exatamente como descrito anteriormente para as reads.

Resultados das estimativas de tamanhos e qualidades das leituras

Arquivos *_trimSizes.txt

Arquivos *_eestats.txt

Estimativas das médias de erros esperados (reads)

Utilização do módulo fastx_info do programa usearch v11.0.667 foi utilizado para a obtenção da estimativa de erro médio dentro de cada biblioteca, considerando as suas reads.

Resultado das estimativas das médias de erros esperados (amplicons)

Arquivo meanEE.txt

Contagens preliminares

Processamento dos Amplicons e obtenção das Amplicon Sequence Variants (ASVs)

As etapas de processamento a seguir foram realizadas no ambiente R v4.1.2.

Avaliação do perfil de qualidade das sequências dos amplicons

As leituras R1 foram carregadas no pacote DADA2 para o reconhecimento dos amplicons. Na Figure 1 a seguir temos uma análise da qualidade das leituras em função do tamanho.

Figure 1: Quality Profile previous DADA2 processing (only one SAMPLE)

Quality Profile previous DADA2 processing (full image)

Filtragem e poda de sequências de amplicons

A seguir foi realizada uma filtragem e poda nas sequências de acordo com o perfil de qualidade observado, dessa forma, consideramos não truncar as sequências até um determinado tamanho (truncLen = 0), com um valor máximo de expectativa de erros (maxEE) de 0,5, removendo amplicons provenientes do controle PhiX e as de baixa complexidade (número efetivo de kmers menor que 5). A intenção também é a de manter o máximo de leituras possível, sem a perda de qualidade.

O resultado (Table 1) pode também ser visualizado na Figure 2 a seguir para apenas uma amostra IPMS2, como representante das demais. O download da imagem completa com todas as amostras pode ser feito pelos links seguintes às imagens.

Table 1: Read after filtering and trimming process

	reads.in	reads.out
CAFS1	160369	146379
CAFS2	148309	135214
CAMS1	143677	130684
CAMS2	163553	149530
CCFS1	210493	97455
CCFS2	196811	93303
CCMS1	203959	94431
CCMS2	191306	90854
CPFS1	143942	58840
CPFS2	173040	65890
CPMS1	219016	94349
CPMS2	197896	75974
CVFS1	213019	96841
CVFS2	200734	93936
CVMS1	178171	80328
CVMS2	221590	103338
DAFS1	87320	79153
DAFS2	36488	33096
DAMS1	61535	55277
DAMS2	78029	70020
DCFS1	116372	47241
DCFS2	64901	27155
DCMS1	231687	94731
DCMS2	86114	36570
DPFS1	136277	56128
DPFS2	123783	49013
DPMS1	79297	37513
DPMS2	83113	33537
DVFS1	68891	28605
DVFS2	95758	40079
DVMS1	157745	67964
DVMS2	153626	67902
IAFS1	160629	146036
IAFS2	124952	113004
IAMS1	148021	133117
IAMS2	148413	134501
ICFS1	134460	57166
ICFS2	167066	70806
ICMS1	188256	77861
ICMS2	121148	47568
IPFS1	155183	61065
IPFS2	217575	100325
IPMS1	334078	143887
IPMS2	236364	107134
IVFS1	221417	98311
IVFS2	122876	50674
IVMS1	149786	61633
IVMS2	105923	44331
JAFS1	129259	116256
JAFS2	82285	74561
JAMS1	159591	144021
JAMS2	143943	129668
JCFS1	181666	75031
JCFS2	146564	60911
JCMS1	155791	65917
JCMS2	123179	52357
JPFS1	226267	93776
JPFS2	195517	82095
JPMS1	204563	86907
JPMS2	129719	54840
JVFS1	105712	43614
JVFS2	144540	53319
JVMS1	335820	140997
JVMS2	112887	39777

Figure 2: Quality Profile post DADA2 filtering and trimming (only one sample)

Quality Profile post DADA2 filtering and trimming (full image)

Identificação das taxas de erros

Os amplicons passaram então por um processo de identificação das taxas de erros a partir de um processo de aprendizado (learnErrors) que alterna entre estimativa de erros e inferência de um modelo para os erros apartir dos dados até atingir convergência. A representação gráfica do resultado deste processo pode ser observado na Figure 3. A sugestão proposta pelo autor do dada2 de forçar a monotonicidade do modelo de erros ajustado foi seguida. O número máximo de iterações na etapa de autoconsistência para estimar a taxa de erros foi incrementada para 25 (MAX_CONSIST = 25). A convergência foi atingida após 15 iterações.

Figure 3: The error rates for each possible transition (A→C, A→G, …) are shown. Points are the observed error rates for each consensus quality score. The black line shows the estimated error rates after convergence of the machine-learning algorithm. The red line shows the error rates expected under the nominal definition of the Q-score.

Inferência das Amplicon Sequence Variants (ASVs)

As sequências de amplicons devidamente podadas e filtradas foram submetidas à deduplicação (dereplication) para em seguida o algoritmo do DADA2 inferir as Amplicon Sequence Variants (ASVs) seguindo um processo de remoção de ruídos (denoising) que leva em conta as taxas de erros identificadas na etapa anterior.

Identificação e filtragem de ASVs quiméricas

O resultado foi de 12267 ASVs. As quais foram submetidas à identificação de quimeras (removeBimeraDenovo) pelo método consensus (as sequências das amostras são analisadas independentemente e uma decisão é tomada por consenso para cada ASV), considerando um mínimo de 100 de abundância para as ASVs que podem ser consideradas candidatas a aparentadas (origem das quimeras) além de uma razão de abundância de no mínimo 10 em relação às potenciais quimeras.

Foram identificadas 676 ASVs quiméricas.

Números de leituras iniciais e abundâncias de ASVs

Abaixo (Table 2) os números de leituras iniciais e de abundâncias de ASVs após os processamentos até o momento.

Table 2: Reads and ASV abundances

ID	Raw.reads	Cleaned.reads	FilteredAndTrimmed.reads	Denoised.asvs.abundance	ChimeraFree.asvs.abundance	NA	ContaminantFree.asvs.abundance	PercentUsable.reads
CAFS1	163941	162608	162271	146379	133521	132108	132108	80.58
CAFS2	151444	150374	150082	135214	124592	123615	123615	81.62
CAMS1	146978	145755	145456	130684	122103	121488	121488	82.66
CAMS2	167274	165995	165647	149530	140362	139499	139499	83.40
CCFS1	216687	216034	213223	97455	91862	91724	91724	42.33
CCFS2	202999	202402	199844	93303	88492	88335	88335	43.51
CCMS1	209990	209360	206593	94431	88442	88329	88329	42.06
CCMS2	196923	196384	193837	90854	85451	85287	85287	43.31
CPFS1	149702	149186	146721	58840	57491	57378	57213	38.22
CPFS2	179192	178410	175469	65890	60765	60720	60720	33.89
CPMS1	225944	225307	222025	94349	88462	88366	88366	39.11
CPMS2	204777	203877	200417	75974	71746	71712	71712	35.02
CVFS1	219402	218806	216016	96841	90552	90244	90244	41.13
CVFS2	206738	206088	203338	93936	88020	87730	87730	42.44
CVMS1	183364	182802	180303	80328	75603	75460	75460	41.15
CVMS2	228355	227641	224443	103338	97726	97311	97311	42.61
DAFS1	89919	89069	88855	79153	77685	77682	74986	83.39
DAFS2	37520	37221	37128	33096	31415	31278	30107	80.24
DAMS1	63626	63025	62852	55277	54113	54113	53928	84.76
DAMS2	80819	79949	79754	70020	69255	69255	69077	85.47
DCFS1	122736	122264	119958	47241	45948	45948	44652	36.38
DCFS2	71285	71052	69459	27155	26210	26210	25582	35.89
DCMS1	241679	240754	236533	94731	93269	93261	91663	37.93
DCMS2	94201	93887	91956	36570	34520	34520	33886	35.97
DPFS1	141958	141413	139058	56128	54566	54566	54430	38.34
DPFS2	132107	131642	129113	49013	47680	47673	47589	36.02
DPMS1	82003	81853	81303	37513	35099	35099	35095	42.80
DPMS2	86790	86511	85030	33537	31655	31655	31655	36.47
DVFS1	71960	71712	70502	28605	26832	26832	26483	36.80
DVFS2	101484	101123	99234	40079	38316	38316	36797	36.26
DVMS1	165859	165240	162414	67964	65906	65906	65088	39.24
DVMS2	161059	160495	157774	67902	65670	65670	64415	39.99
IAFS1	164482	162981	162598	146036	145187	145040	144867	88.07
IAFS2	127785	126693	126453	113004	112451	112403	112068	87.70
IAMS1	151730	150339	150022	133117	132575	132530	132530	87.35
IAMS2	151673	150412	150134	134501	131718	131489	131440	86.66
ICFS1	139909	139294	137047	57166	55466	55466	53919	38.54
ICFS2	172816	172200	169766	70806	68126	68119	67763	39.21
ICMS1	194877	194122	190916	77861	76915	76866	76830	39.42
ICMS2	125665	125217	123052	47568	46412	46412	46412	36.93
IPFS1	160962	160350	157707	61065	60239	60166	60116	37.35
IPFS2	224428	223737	220523	100325	94051	93664	93664	41.73
IPMS1	345759	344508	338773	143887	141391	141391	140958	40.77
IPMS2	244089	243196	239379	107134	104116	104083	104083	42.64
IVFS1	228943	228051	224175	98311	97214	96796	96792	42.28
IVFS2	127420	126977	124970	50674	50127	50127	49995	39.24
IVMS1	156119	155447	152375	61633	59851	59787	59092	37.85
IVMS2	109737	109319	107543	44331	43464	43464	43141	39.31
JAFS1	132370	131141	130880	116256	115232	115139	113279	85.58
JAFS2	84149	83508	83364	74561	73626	73619	69237	82.28
JAMS1	163443	161997	161702	144021	143593	143576	143532	87.82
JAMS2	147745	146335	146024	129668	126979	126963	126893	85.89
JCFS1	188244	187605	184694	75031	74607	74573	74307	39.47
JCFS2	152204	151667	149196	60911	60614	60614	60460	39.72
JCMS1	161387	160867	158300	65917	64271	64271	64131	39.74
JCMS2	127452	127003	125095	52357	50524	50524	49615	38.93
JPFS1	233623	232873	229459	93776	93423	93423	93423	39.99
JPFS2	201772	201164	198133	82095	81554	81554	81532	40.41
JPMS1	211303	210585	207376	86907	85378	85279	85228	40.33
JPMS2	134191	133793	131720	54840	53465	53465	53399	39.79
JVFS1	109795	109392	107567	43614	42973	42973	42811	38.99
JVFS2	150055	149301	146425	53319	52239	52095	52095	34.72
JVMS1	347311	346075	340804	140997	138902	138902	135201	38.93
JVMS2	117324	116755	114501	39777	37933	37896	36913	31.46

Tabela de contagem ASVs

O número total de ASVs válidas é de 11591. As sequências fasta das ASVs podem ser acessadas no link abaixo.

Download ASVs.fa

Atribuição taxonômica às ASVs

Para a atribuição taxonômica, as funções assignTaxonomy() e addSpecies(), ambas do pacote DADA2 foram utilizadas com base nos bancos de dados GTDB (GTDB_bac120_arc122_ssu_r202), RDP (rdp_train_set_18), RefRDP (RefSeq_16S_6-11-20_RDPv16), e SILVA (silva_nr99_v138.1_train_set). As possibilidades de correspondências foram consideradas em ambas as orientações e com um mínimo de valor de bootstrap de 60%.

Identificação e filtragem de ASVs contaminantes

Além disso foram feitas filtragens de ASVs contaminantes ou não classificadas (Padrões buscados: “Chloroplast;”,“Mitochondria;”,“^Unclassified;”,“^Eukaryota;”) resultando em 11474 ASVs válidas livres de contaminantes.

As sequências fasta livre de contaminantes podem ser acessadas no link abaixo.

Download ContaminantFree_ASVs.fa

Resultados das atribuições taxonômicas

As Table 3 e Table 4 sumarizam o resultado das atribuições taxonômicas correspondentes aos diferentes bancos de dados considerados no processo.

Table 3: Somatório da abundância de ASVs com atribuição até determinado nível taxonômico

	Database	Kingdom	Phylum	Class	Order	Family	Genus	Species
2	GTDB	11465	10889	10605	10134	9649	6014	10
3	RDP	11458	11082	10370	10264	8270	3490	11474
4	RefRDP	11458	10841	10065	9929	7248	3536	2
5	Silva	11469	11325	11220	10604	8246	4415	11474

Table 4: ASVs com atribuição até determinado nível taxonômico

	Database	UnqKingdom	UnqPhylum	UnqClass	UnqOrder	UnqFamily	UnqGenus	UnqSpecies
2	GTDB	1	25	45	97	161	289	10
3	RDP	1	16	38	69	113	165	3
4	RefRDP	1	15	32	62	103	154	2
5	Silva	1	19	43	91	133	198	5

Planilha das ASVs com atribuição taxonômica

Por fim, selecionamos as atribuições taxonômicas realizadas com o banco de dados RDP, afinal é um banco de dados que possui curadoria, e portanto, confiabilidade. Além disson, possui uma quantidade satisfatória de ASVs reconhecidas até o nível de gênero.

A planilha contendo os resultados da atribuição taxonômica com o banco de dados RDP pode ser acessada no link abaixo. Além das atribuições taxonômicas ao longo dos níveis, a planilha contém a soma da abundância e o número que representa a prevalência das ASVs entre as amostras.

Download master.xlsx

No geral, houve 89.89% de dados com identificação da família, 73.54% de dados com informação de gênero, e 0.01% de dados com informação de espécie.

A tabela anterior (Table 2) com os números de leituras portanto foi atualizada (Table 5) com novas colunas.

Table 5: Reads and ASVs abundances (updated)

ID	Raw.reads	Cleaned.reads	FilteredAndTrimmed.reads	Denoised.asvs.abundance	ChimeraFree.asvs.abundance	NA	ContaminantFree.asvs.abundance	PercentUsable.reads
CAFS1	163941	162608	162271	146379	133521	132108	132108	80.58
CAFS2	151444	150374	150082	135214	124592	123615	123615	81.62
CAMS1	146978	145755	145456	130684	122103	121488	121488	82.66
CAMS2	167274	165995	165647	149530	140362	139499	139499	83.40
CCFS1	216687	216034	213223	97455	91862	91724	91724	42.33
CCFS2	202999	202402	199844	93303	88492	88335	88335	43.51
CCMS1	209990	209360	206593	94431	88442	88329	88329	42.06
CCMS2	196923	196384	193837	90854	85451	85287	85287	43.31
CPFS1	149702	149186	146721	58840	57491	57378	57213	38.22
CPFS2	179192	178410	175469	65890	60765	60720	60720	33.89
CPMS1	225944	225307	222025	94349	88462	88366	88366	39.11
CPMS2	204777	203877	200417	75974	71746	71712	71712	35.02
CVFS1	219402	218806	216016	96841	90552	90244	90244	41.13
CVFS2	206738	206088	203338	93936	88020	87730	87730	42.44
CVMS1	183364	182802	180303	80328	75603	75460	75460	41.15
CVMS2	228355	227641	224443	103338	97726	97311	97311	42.61
DAFS1	89919	89069	88855	79153	77685	77682	74986	83.39
DAFS2	37520	37221	37128	33096	31415	31278	30107	80.24
DAMS1	63626	63025	62852	55277	54113	54113	53928	84.76
DAMS2	80819	79949	79754	70020	69255	69255	69077	85.47
DCFS1	122736	122264	119958	47241	45948	45948	44652	36.38
DCFS2	71285	71052	69459	27155	26210	26210	25582	35.89
DCMS1	241679	240754	236533	94731	93269	93261	91663	37.93
DCMS2	94201	93887	91956	36570	34520	34520	33886	35.97
DPFS1	141958	141413	139058	56128	54566	54566	54430	38.34
DPFS2	132107	131642	129113	49013	47680	47673	47589	36.02
DPMS1	82003	81853	81303	37513	35099	35099	35095	42.80
DPMS2	86790	86511	85030	33537	31655	31655	31655	36.47
DVFS1	71960	71712	70502	28605	26832	26832	26483	36.80
DVFS2	101484	101123	99234	40079	38316	38316	36797	36.26
DVMS1	165859	165240	162414	67964	65906	65906	65088	39.24
DVMS2	161059	160495	157774	67902	65670	65670	64415	39.99
IAFS1	164482	162981	162598	146036	145187	145040	144867	88.07
IAFS2	127785	126693	126453	113004	112451	112403	112068	87.70
IAMS1	151730	150339	150022	133117	132575	132530	132530	87.35
IAMS2	151673	150412	150134	134501	131718	131489	131440	86.66
ICFS1	139909	139294	137047	57166	55466	55466	53919	38.54
ICFS2	172816	172200	169766	70806	68126	68119	67763	39.21
ICMS1	194877	194122	190916	77861	76915	76866	76830	39.42
ICMS2	125665	125217	123052	47568	46412	46412	46412	36.93
IPFS1	160962	160350	157707	61065	60239	60166	60116	37.35
IPFS2	224428	223737	220523	100325	94051	93664	93664	41.73
IPMS1	345759	344508	338773	143887	141391	141391	140958	40.77
IPMS2	244089	243196	239379	107134	104116	104083	104083	42.64
IVFS1	228943	228051	224175	98311	97214	96796	96792	42.28
IVFS2	127420	126977	124970	50674	50127	50127	49995	39.24
IVMS1	156119	155447	152375	61633	59851	59787	59092	37.85
IVMS2	109737	109319	107543	44331	43464	43464	43141	39.31
JAFS1	132370	131141	130880	116256	115232	115139	113279	85.58
JAFS2	84149	83508	83364	74561	73626	73619	69237	82.28
JAMS1	163443	161997	161702	144021	143593	143576	143532	87.82
JAMS2	147745	146335	146024	129668	126979	126963	126893	85.89
JCFS1	188244	187605	184694	75031	74607	74573	74307	39.47
JCFS2	152204	151667	149196	60911	60614	60614	60460	39.72
JCMS1	161387	160867	158300	65917	64271	64271	64131	39.74
JCMS2	127452	127003	125095	52357	50524	50524	49615	38.93
JPFS1	233623	232873	229459	93776	93423	93423	93423	39.99
JPFS2	201772	201164	198133	82095	81554	81554	81532	40.41
JPMS1	211303	210585	207376	86907	85378	85279	85228	40.33
JPMS2	134191	133793	131720	54840	53465	53465	53399	39.79
JVFS1	109795	109392	107567	43614	42973	42973	42811	38.99
JVFS2	150055	149301	146425	53319	52239	52095	52095	34.72
JVMS1	347311	346075	340804	140997	138902	138902	135201	38.93
JVMS2	117324	116755	114501	39777	37933	37896	36913	31.46

Análise Filogenética

As 11474 livres de contaminantes foram alinhadas com pacote DECIPHER e usando pacote phangorn foi estimada uma árvore filogenética de Máxima Verossimilhança com a função pml() , a partir de uma árvore Neighbor-Joining utilizando parâmetros pré-definidos (default). Essa árvore inicial foi otimizada com a função optimim.pml() considerando rearranjos nos ramos por NNI (Nearest Neighbor Interchange), o modelo evolutivo General Time Reversible (GTR), e a otimização de parâmetros do modelo, tais como a proporção de sítios invariáveis (a partir do valor 0,2) e o parâmetro gamma. Em resumo, a análise filogenética segue a sugestão de (Callahan et al. 2016) exceto pelo método de rearranjo dos ramos.

Arquivos para exploração com MicrobiomeAnalyst

Os arquivos a seguir servem para análises em plataformas externas como o MicrobiomeAnalyst. Essa plataforma exige que os dados estejam em replicatas (NO MÍNIMO 3 RÉPLICAS), dessa forma, cada amostra será replicada 3 vezes por um procedimento de subamostragem com repetição. O procedimento de subamostragem foi realizado com a função rarefy_even_depth() do pacote phyloseq v1.38.0 do R.

Download MA_counts.txt

Download MA_metadata.txt

Download MA_taxonomy.txt

Download MA_tree.nwk

Análises ecológicas

Utilizamos os pacotes phyloseq v1.38.0 e vegan v2.6-4 no R para as análises subsequentes. A seguir temos um resultado do quanto a matriz de ASVs é esparsa ¹ usando a função summarize_phyloseq() que sumariza os resultados do objeto phyloseq sem a rarefação (Sparsity = 0.971296518215095).

Rarefação dos dados

Nessas análises consideramos os dados após a rarefação em relação ao 25º percentil da distribuição de tamanho das amostras (53073) (Figure 4). A rarefação foi feita para as amostras com um número de contagens maiores que o valor definido para a rarefação. As amostras menores que o valor definido foram apenas acrescentadas. Por fim, as ASVs que após a rarefação ficaram zeradas (234) foram removidas. Também podem ser consultados mais detalhes na análise de rarefação por grupos de amostras (Figure 5). As figuras foram geradas a partir da suavização dos valores de contagem de reads e respectivos intervalos de confiança (95%) quando apresentados.

(a) Rarefaction curve (original counts)

(b) Rarefaction curve (rarefied counts)

Figure 4: Curvas de Rarefação

(a) Rarefaction curve (original counts) by SEX

(b) Rarefaction curve (original counts) by TREATMENT

(c) Rarefaction curve (original counts) by SEGMENT

(d) Rarefaction curve (original counts) by SAMPLE (SEGMENT+TREATMENT+SEX)

(e) Rarefaction curve (rarefied counts) by SEX

(f) Rarefaction curve (rarefied counts) by TREATMENT

(g) Rarefaction curve (rarefied counts) by SEGMENT

(h) Rarefaction curve (rarefied counts) by SAMPLE (SEGMENT+TREATMENT+SEX)

Figure 5: Rarefaction analysis by groups

A seguir temos um resultado do quanto a matriz de ASVs após a rarefação é esparsa utilizando a função summarize_phyloseq() que sumariza os resultados do objeto phyloseq, desta vez após a rarefação (Sparsity = 0.970458236658933).

Shared OTUs

A seguir, comparamos as ASVs compartilhadas entre as amostras considerando os dados completos e posteriormente os dados após o procedimento de rarefação descrito na seção anterior.

(a) Percentage of shared ASVs (original dataset) by GROUP

(b) Percentage of shared ASvs (rarefied dataset) by GROUP

Figure 6: Rarefaction analysis by groups

Aglomeração de ASVs da mesma taxonomia

Após a utilização da função tax_glom() selecionando o nível de gênero, na tabela de ASVs temos 210 registros.

Análise de intersecção

As análises de intersecção a seguir estão organizadas por grupos de amostras (SEGMENTO), portanto, os números relacionados ao grau zero de intersecção são as que não entraram na comparação, estão nos demais grupos.

(a) ASV level (DUODENUM)

(b) Genus level (DUODENUM)

(c) ASV level (JEJUNUM)

(d) Genus level (JEJUNUM)

(e) ASV level (ILEUM)

(f) Genus level (ILEUM)

(g) ASV level (CECUM)

(h) Genus level (CECUM)

Figure 7: Intersection analyses (UpSet plots) among TREATMENTS by SEGMENT

Composição taxonômica

A seguir temos a composição dos mais abundantes filos e gêneros em cada amostras (Figure 8). Os gráficos foram gerados a partir do pacote microeco v1.6.0. Para isso, o objeto phyloseq foi convertido para um objeto microeco por meio da função phyloseq2meco() do pacote file2meco v0.7.1.

(a) Phylum level (Top 5)

(b) Genus level (Top 10)

Figure 8: Compositional plot

Alfa diversidade

Os índices de alfa diversidade (“observed”, “chao1”, “diversity_inverse_simpson”, “diversity_gini_simpson”, “diversity_shannon”, “diversity_fisher”, “diversity_coverage”, “evenness_camargo”, “evenness_pielou”, “evenness_simpson”, “evenness_evar”, “evenness_bulla”, “dominance_dbp”, “dominance_dmn”, “dominance_absolute”, “dominance_relative”, “dominance_simpson”, “dominance_core_abundance”, “dominance_gini”, “rarity_log_modulo_skewness”, “rarity_low_abundance”, “rarity_rare_abundance”, “PD”) foram obtidos com a função alpha() do pacote microbiome v.1.16.0. No resultado, há métricas para avaliar riqueza, diversidade, equitabilidade, dominância e raridade. Além disso, também foi calculada uma métrica de diversidade filogenética (Faith’s Phylogenetic Diversity), calculada pela função pd() pacote picante v1.8.2. O resultado (Table 6) foi incorporado também à planilha “Alpha Diversity Indices” do Excel (Section 3.13.8.3).

Para informações sobre os índices de diversidade, incluindo a forma como interpretar os resultados, consulte a seção “Indices of diversity and eveness” da página “Analysis of community ecology data in R” de David Zelený”.

Índices de Alfa diversidade

• Riqueza (referem-se à quantidade de diferentes taxa):
  • observed;
  • chao1;
• Diversidade:
  • inverse_simpson;
  • gini_simpson;
  • shannon;
  • fisher;
  • coverage (refere-se ao número de grupos necessários para terem uma determinada proporção no ecossistema, aqui foi utilizado o valor pré-determinado de 0,5, i.e. 50%);
  • PD: Faith’s Phylogenetic Diversity (calcula a soma do comprimento das ramificações dentro de uma amostra);
• Dominância (referem-se à abundância dos taxa mais abundantes):
  • dbp;
  • dmn;
  • absolute;
  • relative;
  • simpson;
  • core_abundance (refere-se à proporção relativa dos taxa essenciais “core”, i.e. função core_abundance() com os parâmetros: detection = .1/100 e prevalence = 45/100);
  • gini;
• Raridade e baixa abundância (quantificam a concentração de taxa raros ou pouco abundantes):
  • log_modulo_skewness;
  • low_abundance;
  • rare_abundance (complemento de core_abundance: 1-core_abundance(), considerando os parâmetros: detection = 0.2/100, prevalence = 20/100);
• Equitabilidade:
  • camargo;
  • pielou;
  • simpson;
  • evar;
  • bulla;

Download diversity.xlsx

Table 6: Alpha diversity indices

	observed	chao1	diversity_inverse_simpson	diversity_gini_simpson	diversity_shannon	diversity_fisher	diversity_coverage	evenness_camargo	evenness_pielou	evenness_simpson	evenness_evar	evenness_bulla	dominance_dbp	dominance_dmn	dominance_absolute	dominance_relative	dominance_simpson	dominance_core_abundance	dominance_gini	rarity_log_modulo_skewness	rarity_low_abundance	rarity_rare_abundance	PD
CAFS1	1434	1550.41	787.58	0.9987	6.888	328.250	296	0.7149	0.9476	0.5492	0.3903	0.6519	0.0048	0.0088	123	0.0048	0.0013	0.0000	0.9302	1.9079	0.8667	0.9449	557.39
CAFS2	1219	1306.85	724.36	0.9986	6.779	266.461	275	0.7428	0.9539	0.5942	0.4181	0.6795	0.0057	0.0101	145	0.0057	0.0014	0.0000	0.9367	1.8321	0.8286	0.9468	453.76
CAMS1	1117	1176.73	699.73	0.9986	6.731	238.428	269	0.8130	0.9590	0.6264	0.4478	0.7100	0.0047	0.0089	120	0.0047	0.0014	0.0000	0.9389	1.7554	0.7822	0.9655	411.22
CAMS2	1281	1360.46	808.79	0.9988	6.878	283.908	315	0.7706	0.9613	0.6314	0.4761	0.7117	0.0044	0.0087	112	0.0044	0.0012	0.0000	0.9290	1.8306	0.8779	0.9610	425.14
CCFS1	483	491.75	259.62	0.9961	5.790	84.496	96	0.8720	0.9368	0.5375	0.3760	0.6324	0.0116	0.0213	298	0.0116	0.0039	0.0000	0.9769	1.5458	0.2501	0.9620	319.06
CCFS2	406	409.00	220.88	0.9955	5.606	68.521	81	0.8967	0.9334	0.5440	0.3453	0.6274	0.0131	0.0233	335	0.0131	0.0045	0.0000	0.9808	1.4863	0.1918	0.9629	307.30
CCMS1	461	476.81	245.94	0.9959	5.720	79.862	92	0.8688	0.9327	0.5335	0.3062	0.6355	0.0126	0.0241	322	0.0126	0.0041	0.0059	0.9783	1.5119	0.2059	0.9899	338.98
CCMS2	404	406.55	223.07	0.9955	5.605	68.116	85	0.9442	0.9339	0.5522	0.3356	0.6328	0.0133	0.0245	341	0.0133	0.0045	0.0000	0.9807	1.5021	0.1590	0.9893	304.21
CPFS1	214	214.00	133.85	0.9925	5.085	32.013	53	0.6929	0.9477	0.6254	0.4496	0.7117	0.0206	0.0385	527	0.0206	0.0075	0.0267	0.9882	1.0888	0.0460	0.6829	98.56
CPFS2	257	270.75	132.88	0.9925	5.087	39.727	50	0.9546	0.9168	0.5170	0.2582	0.6001	0.0165	0.0325	422	0.0165	0.0075	0.0000	0.9886	1.6137	0.0785	0.9676	261.34
CPMS1	368	378.46	198.35	0.9950	5.486	60.899	75	0.8964	0.9286	0.5390	0.2844	0.6223	0.0149	0.0280	381	0.0149	0.0050	0.0037	0.9829	1.5402	0.1367	0.9677	302.52
CPMS2	313	317.00	155.94	0.9936	5.298	50.195	62	0.9233	0.9220	0.4982	0.2959	0.6191	0.0230	0.0420	588	0.0230	0.0064	0.0000	0.9858	1.5020	0.1045	0.9452	272.95
CVFS1	426	431.35	233.16	0.9957	5.653	72.604	87	0.9136	0.9338	0.5473	0.3250	0.6335	0.0107	0.0206	274	0.0107	0.0043	0.0059	0.9798	1.5527	0.1847	0.9790	321.50
CVFS2	457	467.20	244.68	0.9959	5.719	79.025	91	0.8596	0.9338	0.5354	0.3298	0.6312	0.0123	0.0238	315	0.0123	0.0041	0.0063	0.9784	1.4945	0.2263	0.9821	340.34
CVMS1	400	402.10	248.97	0.9960	5.680	67.306	95	0.9471	0.9480	0.6224	0.3861	0.6927	0.0091	0.0182	234	0.0091	0.0040	0.0019	0.9788	1.3537	0.1480	0.9906	295.31
CVMS2	441	458.14	261.85	0.9962	5.736	75.697	98	0.9056	0.9420	0.5938	0.3383	0.6670	0.0090	0.0179	229	0.0090	0.0038	0.0000	0.9777	1.4720	0.1747	0.9916	324.21
DAFS1	390	392.55	248.89	0.9960	5.662	65.290	95	0.5719	0.9491	0.6382	0.3736	0.6899	0.0096	0.0173	245	0.0096	0.0040	0.0000	0.9791	1.3740	0.1398	0.7705	306.56
DAFS2	309	309.30	150.98	0.9934	5.292	49.432	61	0.6638	0.9229	0.4886	0.3223	0.6409	0.0224	0.0413	574	0.0224	0.0066	0.0000	0.9857	1.5236	0.0815	0.8006	321.22
DAMS1	200	210.11	89.59	0.9888	4.637	29.568	37	0.4322	0.8752	0.4479	0.1610	0.4844	0.0192	0.0381	492	0.0192	0.0112	0.0000	0.9924	1.8818	0.0587	0.1538	321.55
DAMS2	142	146.20	77.24	0.9871	4.430	19.822	33	0.5364	0.8939	0.5440	0.1479	0.5641	0.0204	0.0394	521	0.0204	0.0129	0.0000	0.9935	1.9041	0.0220	0.0928	171.89
DCFS1	206	206.00	129.51	0.9923	5.055	30.612	56	0.6384	0.9488	0.6287	0.3917	0.7546	0.0255	0.0442	652	0.0255	0.0077	0.0700	0.9881	1.3564	0.0205	0.2238	149.96
DCFS2	133	133.00	70.53	0.9858	4.514	18.371	26	0.5785	0.9231	0.5303	0.3487	0.6806	0.0398	0.0751	1019	0.0398	0.0142	0.0666	0.9933	1.2250	0.0141	0.1959	180.84
DCMS1	316	316.86	203.82	0.9951	5.481	50.768	82	0.5557	0.9522	0.6450	0.4073	0.7248	0.0139	0.0272	356	0.0139	0.0049	0.0624	0.9822	1.2366	0.0729	0.3386	187.49
DCMS2	176	176.00	91.49	0.9891	4.822	25.457	34	0.6297	0.9326	0.5198	0.5187	0.6873	0.0303	0.0580	775	0.0303	0.0109	0.0565	0.9908	1.3427	0.0275	0.3166	154.14
DPFS1	221	221.00	145.66	0.9931	5.155	33.248	58	0.6039	0.9550	0.6591	0.4859	0.7466	0.0171	0.0337	438	0.0171	0.0069	0.0721	0.9871	1.2244	0.0279	0.2427	102.44
DPFS2	209	212.33	131.48	0.9924	5.074	31.136	52	0.6493	0.9498	0.6291	0.3899	0.7422	0.0228	0.0398	584	0.0228	0.0076	0.0732	0.9879	1.3828	0.0179	0.2582	244.22
DPMS1	227	227.00	124.37	0.9920	5.083	34.314	47	0.6739	0.9371	0.5479	0.4635	0.6798	0.0247	0.0460	631	0.0247	0.0080	0.0340	0.9883	1.2686	0.0553	0.5413	180.13
DPMS2	176	176.00	88.87	0.9887	4.776	25.457	31	0.6515	0.9237	0.5049	0.4517	0.6473	0.0265	0.0522	678	0.0265	0.0113	0.0249	0.9914	1.1787	0.0367	0.4913	195.31
DVFS1	166	166.00	99.12	0.9899	4.791	23.776	37	0.5999	0.9372	0.5971	0.4201	0.6913	0.0244	0.0459	625	0.0244	0.0101	0.0084	0.9913	0.9914	0.0417	0.3569	165.32
DVFS2	212	212.00	112.60	0.9911	4.989	31.662	45	0.5423	0.9313	0.5311	0.3985	0.6796	0.0324	0.0540	829	0.0324	0.0089	0.0542	0.9893	1.1983	0.0448	0.2219	335.56
DVMS1	286	289.00	154.67	0.9935	5.299	45.091	57	0.7697	0.9369	0.5408	0.4412	0.6651	0.0224	0.0382	574	0.0224	0.0065	0.0062	0.9856	1.2720	0.1190	0.7110	322.18
DVMS2	252	252.25	127.06	0.9921	5.127	38.815	51	0.6490	0.9273	0.5042	0.3788	0.6595	0.0322	0.0508	823	0.0322	0.0079	0.0493	0.9878	1.2668	0.0782	0.5210	233.13
IAFS1	290	290.86	209.36	0.9952	5.458	45.841	82	0.5675	0.9626	0.7219	0.4538	0.7355	0.0102	0.0200	262	0.0102	0.0048	0.0000	0.9825	1.2205	0.1051	0.7248	62.36
IAFS2	235	237.00	145.05	0.9931	5.138	35.743	55	0.5992	0.9411	0.6172	0.3944	0.6706	0.0152	0.0279	388	0.0152	0.0069	0.0000	0.9878	1.2702	0.0725	0.6750	61.03
IAMS1	270	272.33	200.59	0.9950	5.394	42.116	79	0.5879	0.9635	0.7429	0.3626	0.7708	0.0103	0.0201	264	0.0103	0.0050	0.0000	0.9832	1.2370	0.0271	0.7087	87.77
IAMS2	728	736.00	442.19	0.9977	6.295	139.554	167	0.5648	0.9552	0.6074	0.5083	0.6896	0.0075	0.0141	193	0.0075	0.0023	0.0000	0.9610	1.6161	0.5142	0.8283	199.73
ICFS1	216	219.00	131.50	0.9924	5.051	32.365	49	0.6024	0.9398	0.6088	0.3848	0.6844	0.0160	0.0319	410	0.0160	0.0076	0.0647	0.9888	1.1804	0.0573	0.4161	164.25
ICFS2	264	264.50	146.67	0.9932	5.189	41.010	54	0.7765	0.9307	0.5556	0.3876	0.6300	0.0146	0.0281	374	0.0146	0.0068	0.0276	0.9874	1.3335	0.1130	0.8465	226.51
ICMS1	259	260.20	187.96	0.9947	5.368	40.093	76	0.6120	0.9659	0.7257	0.4824	0.7796	0.0150	0.0280	384	0.0150	0.0053	0.0328	0.9837	1.2780	0.0375	0.4787	95.75
ICMS2	157	157.00	91.73	0.9891	4.726	22.279	38	0.6752	0.9347	0.5843	0.3521	0.6966	0.0290	0.0539	741	0.0290	0.0109	0.0000	0.9917	1.0855	0.0199	0.6762	98.84
IPFS1	112	112.00	76.18	0.9869	4.464	15.057	33	0.5929	0.9460	0.6802	0.2889	0.7641	0.0342	0.0624	876	0.0342	0.0131	0.1730	0.9933	1.1140	0.0095	0.1146	75.28
IPFS2	464	484.65	241.51	0.9959	5.693	80.491	90	0.8376	0.9272	0.5205	0.2825	0.6075	0.0118	0.0233	301	0.0118	0.0041	0.0058	0.9791	1.6282	0.1951	0.9557	353.10
IPMS1	254	254.55	98.67	0.9899	4.908	39.179	38	0.4620	0.8864	0.3885	0.2662	0.5248	0.0323	0.0590	826	0.0323	0.0101	0.0030	0.9906	1.6311	0.1101	0.7599	207.00
IPMS2	463	463.12	295.77	0.9966	5.877	80.281	115	0.6370	0.9575	0.6388	0.5357	0.7159	0.0121	0.0221	310	0.0121	0.0034	0.0383	0.9740	1.3686	0.2602	0.7368	210.93
IVFS1	201	202.20	94.87	0.9895	4.810	29.741	37	0.5974	0.9070	0.4720	0.2845	0.5704	0.0311	0.0580	796	0.0311	0.0105	0.0104	0.9913	1.3739	0.0838	0.7681	92.59
IVFS2	85	85.00	66.43	0.9849	4.290	10.959	29	0.6556	0.9657	0.7816	0.4300	0.8320	0.0364	0.0663	930	0.0364	0.0151	0.1743	0.9942	1.0817	0.0029	0.0137	42.05
IVMS1	262	262.00	158.35	0.9937	5.276	40.643	61	0.6286	0.9474	0.6044	0.4974	0.7011	0.0195	0.0350	500	0.0195	0.0063	0.0226	0.9858	1.2263	0.0695	0.7582	130.09
IVMS2	116	116.00	76.28	0.9869	4.483	15.680	32	0.5593	0.9430	0.6576	0.3954	0.7296	0.0356	0.0630	911	0.0356	0.0131	0.1415	0.9934	1.0218	0.0177	0.1632	65.41
JAFS1	347	352.50	219.50	0.9954	5.533	56.765	84	0.5247	0.9460	0.6326	0.3160	0.6920	0.0104	0.0205	267	0.0104	0.0046	0.0000	0.9815	1.3138	0.0939	0.5532	138.42
JAFS2	294	299.60	179.68	0.9944	5.365	46.593	66	0.5328	0.9440	0.6112	0.3591	0.6790	0.0134	0.0242	343	0.0134	0.0056	0.0000	0.9846	1.2130	0.1089	0.6311	109.23
JAMS1	96	96.60	70.66	0.9858	4.308	12.605	31	0.6819	0.9438	0.7360	0.1965	0.7489	0.0228	0.0442	583	0.0228	0.0142	0.0000	0.9940	1.1555	0.0134	0.0314	46.67
JAMS2	193	261.44	72.12	0.9861	4.357	28.358	31	0.3660	0.8278	0.3737	0.0941	0.3960	0.0226	0.0446	579	0.0226	0.0139	0.0000	0.9939	2.0213	0.0205	0.0426	256.88
JCFS1	92	92.20	65.37	0.9847	4.287	12.003	28	0.6069	0.9480	0.7106	0.2204	0.7841	0.0362	0.0658	927	0.0362	0.0153	0.1562	0.9943	1.1586	0.0024	0.0225	64.16
JCFS2	78	78.00	64.44	0.9845	4.252	9.931	28	0.6759	0.9759	0.8261	0.5104	0.8547	0.0368	0.0675	941	0.0368	0.0155	0.1949	0.9943	1.4196	0.0004	0.0118	30.86
JCMS1	158	158.33	79.13	0.9874	4.558	22.445	33	0.4776	0.9003	0.5008	0.2397	0.5791	0.0327	0.0578	837	0.0327	0.0126	0.1526	0.9931	1.7222	0.0446	0.1532	167.17
JCMS2	173	173.50	85.80	0.9883	4.667	24.951	34	0.4913	0.9056	0.4959	0.2752	0.5859	0.0305	0.0586	781	0.0305	0.0117	0.1523	0.9925	1.4485	0.0601	0.2385	175.98
JPFS1	94	94.33	63.09	0.9842	4.292	12.303	27	0.5792	0.9446	0.6712	0.3025	0.7548	0.0391	0.0746	999	0.0391	0.0158	0.1722	0.9945	1.0725	0.0072	0.0157	43.80
JPFS2	113	113.00	68.52	0.9854	4.396	15.213	28	0.5322	0.9299	0.6064	0.3209	0.6899	0.0385	0.0688	985	0.0385	0.0146	0.1548	0.9940	0.9813	0.0158	0.0285	46.87
JPMS1	275	287.00	160.21	0.9938	5.243	43.042	63	0.5227	0.9335	0.5826	0.2980	0.6520	0.0154	0.0303	394	0.0154	0.0062	0.0696	0.9863	1.4336	0.0901	0.2323	209.76
JPMS2	217	217.50	131.42	0.9924	5.051	32.542	53	0.5415	0.9389	0.6056	0.3405	0.6915	0.0227	0.0415	580	0.0227	0.0076	0.0858	0.9885	1.2873	0.0320	0.1172	146.34
JVFS1	93	93.00	69.17	0.9855	4.335	12.153	30	0.6309	0.9564	0.7438	0.3250	0.8071	0.0359	0.0637	918	0.0359	0.0145	0.1376	0.9939	1.0746	0.0085	0.0290	55.08
JVFS2	137	137.00	77.78	0.9871	4.569	19.014	33	0.7239	0.9286	0.5677	0.3440	0.6870	0.0382	0.0711	978	0.0382	0.0129	0.0283	0.9929	0.9789	0.0285	0.7432	98.22
JVMS1	193	196.00	76.43	0.9869	4.579	28.358	31	0.3848	0.8700	0.3960	0.1940	0.4892	0.0369	0.0641	944	0.0369	0.0131	0.1802	0.9931	1.7818	0.0686	0.1101	214.07
JVMS2	141	141.00	71.12	0.9859	4.515	19.660	29	0.5038	0.9124	0.5044	0.3319	0.6400	0.0391	0.0750	1000	0.0391	0.0141	0.1399	0.9934	1.2009	0.0478	0.2380	155.43

Comparações de Alfa diversidade

Também foram realizadas comparações entre as crianças considerando um índice de riqueza (observed) e um outro de diversidade (shannon). A Figure 9 exibe as diferenças referente a esses índices nas amotras por segmento do intestino e tratamento (SEGMENT_TREATMENT). Considerando cada amostra um ambiente, podemos considerar que a diversidade relacionada ao conjunto de todas as amostras (POOLs) como sendo a diversidade gama (Figure 10), ou seja, são os mesmos índices de diversidade alfa porém considerando todo o conjunto de amostras consideradas no sequenciamento.

(a) Richness index (observed)

(b) Diversity index (shannon)

Figure 9: Alpha diversity indices by segment and treatment

(a) Richness index (observed)

(b) Diversity index (shannon)

Figure 10: Gamma diversity indices

Um outro método para avaliação da alfa diversidade é a baseada nos números de Hill, portanto, realizamos uma análise com o pacote hilldiv v1.5.1 do R (Figure 11).

(a) Alpha diversity profiles by SAMPLE

(b) Alpha diversity profiles by SEGMENT & TREATMENT

(c) Alpha diversity profiles by SEGMENT & TREATMENT (Log-transformed)

(d) Gamma diversity profile

Figure 11: Hill diversity plots

Beta diversidade

Também foram realizadas análises de Beta diversidade comparando as amostras usando Análises de Coordenadas Principais (PCoA) com distâncias categóricas de Jaccard (presença/ausência) e Bray-curtis (quantitativa), e as distâncias UniFrac que levam em conta as relações filogenéticas. As distâncias UniFrac consideradas foram a ponderada, em que as diferenças entre as abundâncias dos taxa são consideradas, e a não-ponderada, em que não se considera essas diferenças de abundâncias. Veja apresentação sobre distâncias neste link e métodos de ordenação neste link. A diversidade beta observada pode ser avaliada por meio das figuras a seguir (Figure 12 e Figure 13).

(a) Bray-curtis distance

(b) Jaccard distance

(c) Weighted UniFrac distance

(d) Unweighted UniFrac distance

Figure 12: Beta diversity analyses using PCoA ordination (SAMPLE)

(a) Bray-curtis distance

(b) Jaccard distance

(c) Weighted UniFrac distance

(d) Unweighted UniFrac distance

Figure 13: Beta diversity analyses using PCoA ordination (SEGMENT_TREATMENT)

Análise de abundância diferencial

Aqui podemos fazer uma comparação da abundância dos taxa (gêneros) entre as microbiotas nos segmentos do intestino sob um determinado tratamento, para os dois pools de amostras de aves, considerando machos e fêmeas. A avaliação da abundância diferencial foi realizada com o pacote DESeq2 v1.34.0, a partir da matrix após a filtragem dos taxa com valores de abundância baixos de acordo com a abundância mínima de 10 em ao menos 1 amostra. A normalização dos dados foi realizada seguida de transformação logarítmica. A abundância diferencial foi avaliada aplicando modelo linear generalizado (Generalized Linear Model - GLM) considerando um ajuste a uma distribuição de probabilidade binomial negativa (Negative Binomial GLM). As significâncias dos coeficientes do GLM (gêneros) foi avaliada com o teste de Wald (Generalized Linear Model Likelihood Ratio Test). Os dados tiveram seus níveis descritivos de significância estatística (p-values) ajustados (adjusted p-values) pela taxa de falsas descobertas (False Discovery Rate, ou FDR). Os dados de abundância das amostras exibidos e suas médias foram previamente transformados utlizando a transformação Log2 (função normTransform() do pacote DESeq2 com parâmetro f=log2 e pc=1 para indicar pseudocontagem de 1).

Essa comparação foi realizada utilizando como entrada a aglomeração dos ASVs em gêneros e foram filtrados 114 gêneros, sem que os grupos de amostras tivessem a soma das abundâncias mínima de 10. Assim como bibliotecas sem um mínimo de soma de abundâncias (10), também foram removidas (). Um Heatmap foi montado com os gêneros que tiveram alguma diferença de abundância significativa (adj-p-value < 0.1) a partir da comparação de abundância diferencial entre os grupos em cada tempo (Figure 14). Os dendrogramas foram construídos a partir do algoritmo de agrupamento hierárquico com distância euclideana e método de ligação ward.D2. Os valores para o gráfico foram escalados para z-score. Os valores relacionados ao cálculo de diferença de abundância foram inseridos em planilhas do arquivo Excel a seguir:

Download Differential_Abundance.xlsx

(a) DUODENUM

(b) JEJUNUM

(c) ILEUM

(d) CECUM

Figure 14: Heatmap of top 30 most abundant genus

Outros heatmaps foram gerados com anotações das amostras (grupos) e com todas os gêneros que tiveram abundância normalizada e possuem mais do que zero de contagem nas amostras de cada tempo (Figure 15). Os dados de abundância das amostras exibidos nesses heatmaps foram previamente transformados utlizando a transformação VST (variance stabilizing transformation) desconsiderando o desenho experimental (função varianceStabilizingTransformation() do pacote DESeq2 com parâmetro blind=TRUE). Os dendrogramas foram construídos a partir do algoritmo de agrupamento hierárquico com distância euclideana e método de ligação ward.D2.

(a) DUODENUM

(b) JEJUNUM

(c) ILEUM

(d) CECUM

Figure 15: Heatmap of genus abundances among samples by SEGMENT

Figure 1: Quality Profile previous DADA2 processing (only one SAMPLE) Figure 2: Quality Profile post DADA2 filtering and trimming (only one sample) Figure 3: The error rates for each possible transition (A→C, A→G, …) are shown. Points are the observed error rates for each consensus quality score. The black line shows the estimated error rates after convergence of the machine-learning algorithm. The red line shows the error rates expected under the nominal definition of the Q-score.

References

Callahan, Ben J., Kris Sankaran, Julia A. Fukuyama, Paul J. McMurdie, and Susan P. Holmes. 2016. “Bioconductor Workflow for Microbiome Data Analysis: From Raw Reads to Community Analyses.” F1000Research 5 (November): 1492. https://doi.org/10.12688/f1000research.8986.2.

Footnotes

1. esparsa: valores espalhados, ou seja, com muitos zeros na matriz de abundâncias.